分析ELISA检测中为什么会引发灰区
点击次数：950 更新时间：2019-05-21
ELISA 测定的阳性判断值，通常是将大量阴性和阳性人群的测定数据进行统计分析后确定的，其确定依据为判断结果的假阳性和假阴性率低。在阳性判断值周围一定范围内之外的测定结果可归为可疑，亦即ELISA 测定的“灰区”。“灰区”的大小可用统计学方法确定。测定结果处于“灰区”的样本，可通过确认试验或追踪检测来确定到底是阳性还是阴性ELISA“灰区”是把定量分析的正常值范围引入定性分析而建立的概念。
灰区的设置有二种： （1）CO × （1±C） ，C 为该试剂的批内C （一般在15%～ 20% 间） ；（2）CO ±2S，S 为做室内ROC 的S。
另外，个人认为： ELISA“灰区”对于不同项目和应用的领域不同，其设置不能一概而论。根据美国疾病控制中心 （CDC） 对美国Ortho 的抗HC 检测的ELISA 试剂盒进行研究，发现只有检验结果S/CO ≥318 时，高度预示HC 抗体真阳性状态；若检验结果S/CO < 318，存在较高的假阳性。在血站系统的献血员抗HC 筛查用上述两种灰区的设置方法没有什么不可；如果临床实验室抗HC 的灰区也按前者设置，势必存在较多的假阳性。
ELISA 质量保证是一个复杂的过程，许多重要的环节都影响到检测的质量。现分析如下。
1、试剂因素：检测的原理均基于抗原抗体反应。由于该反应过程受多种因素的影响，如普遍存在基质效应、交叉反应等，因而检测结果难以溯源，不同方法、不同试剂之间甚至同一试剂不同批号间结果均缺乏可比性。试剂质量在很大程度上决定了检测的水平，因此在引入新项目之前必须对试剂进行严格的评估。试剂的评估有以下几个步骤： （1） 确定开展该项目的必要性；
（2） 了解该项目现有的检测方法和原理；
（3） 在了解试剂的组成基础上选择多家试剂盒进行比较，判断标准理想参考方法或参考物质，其次为临床的满意度及机构的报告如各级室间质量评价、CDC 报告等；
（4） 定期对检测结果进行追踪反馈直至终认可该试剂。
2、方法学：ELISA 测定模式包括以下几种： 双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM 抗体捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。
3、样本因素：标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素，前者包括类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体、溶菌酶等，后者包括标本溶血、标本被污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全、冷冻标本的反复冻融等。其中外源性干扰因素是我们在检测过程中可以避免也是必须避免的因素，而避免内源性因素的干扰则主要通过选择合适的试剂盒，在临床中遇到少见的疑难病例时应当考虑到内源性干扰因素的存在。
4、操作因素：ELISA 测定一般遵循以下步骤，包括固相包被→加样品→温育→洗涤→加酶结合物→温育→洗涤→加底物→温育→显色→终止显色→比色。目前各种形式的ELISA 自动分析仪已经进入市场，如广泛应用于血站系统的微板式全自动酶免分析仪，其试剂为开放式的，而对于其它类型的，则试剂和仪器往往是配套的。但当前大部分医学实验室均采用手工操作加仪器测定的方式。ELISA 操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。
