ELISA即酶联吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，下面盘点ELISA测定操作技术要求如下：

1、严格按照试剂说明书进行操作。

2、检测前应将试剂放置室温平衡半小时，洗涤液应现用现配，同时观察浓缩洗涤液中有无结晶，若有结晶应放37℃水浴中融化后方可使用。加入底物TMB时应注意有无颜色变化，若已显色则可能过期或变质，也不可使用。

3、加样后及时放入孵育箱。标本较多时，要分批操作。按照说明书步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗*。

4、封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，不会引起孔间的污染，产生周边现象从而导致“花板“的出现。

5、应保证酶标版清洁，整个操作过程中保证酶标版不接触次氯酸。

6、加酶试剂后用吸水纸在酶标版表面轻拭吸干。

7、合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。

8、手动洗板时，加洗液要快速，没有多道移液器可以使用洗瓶。洗液应新鲜配制，以免被其他试剂污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水纸上拍板，选用无粉尘和碎屑的吸水纸。需要用力拍板，使孔内没有可见液体挂壁；但也不能太重，不能让样品干太久。酶标板拍干后立即做后续的加液。

9、用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完版后在吸水纸（选择干净，无尘的吸水材料）上轻轻拍干。若血清中的纤维蛋白或洗涤液中有结晶，将堵塞洗板机针孔，造成全堵或半堵状态，以致使未结合的酶标记物不能*洗脱，而使最后底物显色时加深，造成假阳性或花板。废液瓶装满后应及时清空，以防止废液回流对管道的污染，而使洗涤不*，造成花板。洗板结束后应用蒸馏水*清洗管道，以防止废液在管道中的残留。洗涤次数及加液量不可*按照试剂说明书设定，应根据本实验室的实际情况来设定，开展新项目前，应做好验证工作，根据洗涤的效果来决定洗涤的次数和加液量。同时应根据仪器维护保养程序，定期对洗板机进行维护保养。

10、加样量的准确与否，直接影响抗原抗体结合物的浓度，直至最后显色的深浅。吸嘴插入血清不可太深，若插入太深，吸嘴外壁可能粘连太多血清，轻微的抖动动即可将吸咀外壁的血清溅入其它包被孔中，造成交叉污染。加样时应尽可能的垂直加样，并加在包被孔的底部，不可加在孔的上部。标本量大时，可考虑使用排枪加试剂，可提高速度，但使用排枪时应注意吸嘴一定要装好，不可松动，否则会影响加样量的准确度。加样时保持显色剂不外流，显色剂应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。

11、加样时间间隔对结果也有一定的影响，在竞争抑制法试验中，理论上应该是标本与酶标抗体混合后同时加入反应孔，若标本先于酶标抗体加入反应孔，则标本会先与包被抗体进行反应，造成特异性假阳性。若是有干扰物质存在时表现明显，在公平条件下，干扰物质与包被抗体的结合能力会低于标本，而在非公平条件下，干扰物质会优先与包被抗体进行结合，出现假阳性。做HBcAb项目时，若标本与酶加样时间间隔太长，会引起吸光度的趋势性变化，会造成吸光度的降低。特别是针对临界值标本，出现假阳性。

12、洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，各种试剂盒的洗液不要混用。洗液需要稀释时，应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的超纯水或双蒸水，电导率小于1.5μS/cm,洗液如果结晶应待其溶解后配制。配制后要测定其pH值，使其范围在7.2-7.4之间。