一文与您分享荧光定量PCR试剂盒的设计原理
点击次数：793 更新时间：2023-05-26
荧光定量PCR(Real-time PCR)技术是一种能够实现快速、精确、灵敏检测的分子生物学方法。其原理是在PCR反应过程中同时监测靶基因扩增产物数量的动态变化，从而推算出样本中对应靶基因初始含量的一种手段。
荧光定量PCR试剂盒是荧光定量PCR技术的重要组成部分，在荧光定量PCR实验中起着至关重要的作用。荧光定量PCR试剂盒通常包括模板DNA、引物（Forward和Reverse）以及探针（Probe）、酶（如Taq DNA聚合酶）、荧光染料等多种组分，这些试剂分别发挥不同作用协同完成PCR反应。
荧光定量PCR试剂盒中的引物和探针的设计与选择具有很高的专业性和针对性，在针对不同的目的和实验设计情况下具有各自优劣。引物序列需要与所需扩增的靶基因区域匹配，引物都有向前和向后两个方向，以保证对两侧位于核苷酸互补链上的DNA序列进行扩增。而探针则要求与引物具有一定的覆盖长度，其序列应优化至适合搭配引物并兼顾荧光特性和检测灵敏度。目前常用的探针是TaqMan探针、MGB探针和MolecularB beacon等。
同时，在PCR反应的早期，反应产生非特异性PCR产物，这些产品通过DNA双链发生耦合阻碍扩增产物的累积，严重影响了PCR检测结果的准确性。为此，荧光定量PCR试剂盒需要添加Uracil-DNA聚合酶(UDG)和dUTP将残余外源DNA分解，降低污染以及所得PCR扩增产物的假阳性率，提高PCR实验的稳定性和准确度。
除此之外，荧光定量PCR试剂盒增加荧光染料和探测器以实现实时监控和定量 PCR 反应，它能够不断进行获取数据，在PCR过程中计算核酸扩增本原数量，并在实时显示屏幕上展示出制品的表达大小。因此，荧光定量PCR技术广泛应用于基因分型和基因定量以及细胞凋亡等相关研究。
