核酸提取及纯化试剂盒

RNA和DNA提取：

裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异，但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

Chaotropes（离液剂）的作用：Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

洗涤剂：除了离液剂外，裂解缓冲液中通常还有一些去污剂，以帮助蛋白质溶解和裂解。

溶jun酶和蛋白酶K:根据样品类型，也可以使用酶进行裂解。

提取步骤：

1.从负八十冰箱取出样品，放置于冰上缓慢解冻； （提前预冷离心机至4度）

2.待解冻后（红色），加入200 μl氯仿（加入氯仿体积为Trizol体积的1/5），剧烈震荡（乳白红色），冰上静置10 min。 （氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相。）

3.放置于预冷离心机，离心（4度，12000 rpm，15 min），离心后可见明显分三层（上层无色透明水相为RNA层，中间很薄的乳白色为DNA层，下层为红色为蛋白层）。

4.小心缓慢吸取上清，约400 μl（宁可少吸，也不要多吸取），置于另一个新的1.5 ml RNase-free EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，常温静置放置15 min。

5.离心（4度，12000 rpm，15 min），可见白色沉淀（有时细胞较少看不到沉淀，可放置负二十或负八十两小时再继续后面步骤）

6.弃上清，每管加入950 ul 75% 乙醇，上下颠倒混匀（切记不要用枪吹打混匀，这样会造成RNA溶解）。

7.离心（4度，12000 rpm，10 min），可见底部明显白色沉淀。

8.离心后，弃掉上清，放入离心机再次瞬离，用10 μl 的移液器洗去残留液体， 开盖晾干（约5 min）。

9.每个样品根据沉淀大小加入适量DEPC水（一般20~30 μl，有时看不到沉淀，可加10 μl DEPC水溶解），吹打溶解RNA，十一楼酶标仪测浓度，OD值（260/280=1.8-2.0）标记，负八十保存。

备注：对于中性粒细胞提取RNA建议细胞数目大于2x106/样品；

备注：操作过程中佩戴口罩。

特点优势：

    1.特异性：所有产品使用的引物均经过详尽的生物信息学分析，经过GenBank及自建庞大数据库的比对，确保所用的每一条引物均为种属或血清型特异的基因序列区段，可实现对细菌种属及血清型的特异检测，特异性均达到佳 。

    2.   重现性：该系列所有产品均经过大量实验菌株的验证，重现性为佳 。

    3.   灵敏性：该系列产品可实现对检测菌的高灵敏检测，当样品中细菌的浓度达到103cfu/ml时，可实现对其的直接检测，无需繁琐的增菌过程。

    4.   实用性：检测范围广，涵盖了对人体危害较为严重的17种呼吸道及肠道致病菌，可实现对临床样品及其他环境取样的快速检测，整个检测过程为3-4个小时。

    5.   优势1：序列资源丰富，除GenBank公布的序列外，公司还进行了大量菌株的序列破译，从理论上保证所选引物具有良好的保守性和特异性。

    6.   优势2：该系列试剂盒均经过大量的保守性及特异性实验验证，凭借公司拥有的丰富的菌种资源，每一种检测试剂盒均经过了20余种标准菌株和临床菌株的保守性验证及40余种近缘标准菌株和临床菌株的特异性验证，确保在使用过程中不会出现任何的假阳性及假阴性报告结果。

设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是 末及倒数 个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列 有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

注意事项: 

1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

2.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

3.请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔di一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请再乘以总稀释倍数（×n×5）。

4.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5.底物请避光保存。

6.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

7.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

8.本试剂不同批号组分不得混用。

9.不能使用过期产品。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。